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頂尖HIV研究團(tuán)隊(duì)新冠重磅研究：某稀有抗體反復(fù)出現(xiàn)提示疫苗線索
新冠病毒進(jìn)入細(xì)胞取決于病毒的S蛋白(spike protein)與人類細(xì)胞受體的結(jié)合域(RBD)。盡管尚無新冠疫苗，但抗體對全球抗疫至關(guān)重要。目前，一支頂尖艾滋病研究團(tuán)隊(duì)已從新冠康復(fù)者的血漿中提取、鑒定抗體，并發(fā)現(xiàn)了高中和活性、稀有但反復(fù)出現(xiàn)的RBD特異性抗體。這提示根據(jù)該抗體研發(fā)的疫苗，可能對大眾普遍有效。以上發(fā)現(xiàn)來自醫(yī)學(xué)預(yù)印本網(wǎng)站bioRxiv刊發(fā)的美國洛克菲勒大學(xué)、加州理工大學(xué)、霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所、陳·扎克伯格生物中心(Chan Zuckerberg Biohub)的新冠抗體重磅研究：Convergent Antibody Responses to SARS-CoV-2 Infection in Convalescent Individuals。論文刊發(fā)時(shí)間為當(dāng)?shù)貢r(shí)間5月15日，通訊作者有美國洛克菲勒大學(xué)分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室主任Michel Nussenzweig和Paul Bieniasz教授等。
Michel Nussenzweig教授(左)Paul Bieniasz教授(右)作為艾滋病領(lǐng)域的頂尖學(xué)者，Nussenzweig的研究聚焦于免疫系統(tǒng)固有和適應(yīng)性反應(yīng)的分子機(jī)制，研究方法結(jié)合了生物化學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)。他專注于B淋巴細(xì)胞和HIV-1抗體研究。為應(yīng)對COVID-19暴發(fā)，Nussenzweig已將其研究擴(kuò)展到SARS-CoV-2，并從康復(fù)患者體內(nèi)分離并鑒定高效的中和抗體。另一位通訊作者Paul Bieniasz教授同樣是艾滋病領(lǐng)域的頂尖學(xué)者。他的研究試圖定義宿主基因如何影響病毒的復(fù)制，重點(diǎn)是人類和靈長類動物免疫缺陷病毒。其實(shí)驗(yàn)室致力于表征病毒模仿、操縱和以其他方式利用的宿主功能，以及防御細(xì)胞針對病毒感染而進(jìn)化的特征。當(dāng)?shù)貢r(shí)間5月13日，世衛(wèi)組織(WHO)衛(wèi)生緊急項(xiàng)目負(fù)責(zé)人邁克爾·瑞安(Mike Ryan)表示，新冠病毒可能成為長期問題，很難預(yù)測何時(shí)可以戰(zhàn)勝病毒，它可能成為永遠(yuǎn)不會消失的流行性病毒。瑞安以艾滋病為例，指出盡管艾滋病毒沒有消失，但人類已找到治療方法和預(yù)防手段，人們也不再像以前那樣恐懼艾滋病。附：研究方法新冠病毒的S蛋白負(fù)責(zé)與人體受體結(jié)合入侵，這通常是藥物研發(fā)的重要靶標(biāo)。在感染過程中，S蛋白被宿主蛋白酶(如TMPRSS2)裂解為N端S1亞基和C端S2亞基，S1和S2分別介導(dǎo)受體結(jié)合和膜融合。其中，S1包含N末端結(jié)構(gòu)域(NTD)和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，在確定組織向性和宿主范圍方面至關(guān)重要。在病毒入侵人體時(shí)，RBD會與人類受體ACE2(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2)結(jié)合。但目前，關(guān)于人類對SARS-CoV-2的抗體應(yīng)答知之甚少。在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)報(bào)告了68名COVID-19康復(fù)者，并且均未住院。這些康復(fù)者在癥狀發(fā)作后30天收集的血漿的半最大中和滴度范圍分布各不相同，從不可檢測(占樣本的18%)到低于1：1000(占樣本的78%)，只有3%的康復(fù)者大于1：5000?？贵w克隆顯示了RBD特異性記憶B細(xì)胞(表達(dá)密切相關(guān)的抗體)在不同個(gè)體中的擴(kuò)增克隆。盡管血漿滴度較低，但針對RBD上獨(dú)特表位的抗體的半抑制濃度可以在低至ng/mL級別時(shí)進(jìn)行中和。以此，大多數(shù)未住院而從COVID-19中恢復(fù)的個(gè)體，其恢復(fù)性血漿不包含高水平的中和活性。然而，在所有測試的個(gè)體中都發(fā)現(xiàn)了具有有效抗病毒活性的稀有但反復(fù)出現(xiàn)的RBD特異性抗體，這表明根據(jù)此類抗體研發(fā)的疫苗可能普遍有效。在2020年4月1日至4月17日之間，有73名符合條件的參與者進(jìn)入了研究。其中有48名(65.8%)是通過RT-PCR確診的新冠患者(下稱“病例”)，25名(34.2%)是診斷病例的密切接觸者(下稱“接觸者”)。有5例沒有出現(xiàn)癥狀的密切接觸者被排除在進(jìn)一步分析之外。收集樣本時(shí)，這68人已經(jīng)至少14天不再有任何癥狀。只有一名SARS-CoV-2核酸檢測是陽性的無癥狀者，其他67名參與者平均發(fā)病時(shí)間約為樣本采集前30天(17至48天)。在該隊(duì)列中，癥狀平均持續(xù)10天(0-28天)，并且都未入院。最常見的癥狀是發(fā)燒(82.4%)，咳嗽(64.7%)，肌痛(55.9%)和疲勞(54.4%)，合并癥則很少見(8.8%)。性別之間，病例與接觸者之間，癥狀的持續(xù)時(shí)間或嚴(yán)重程度，或癥狀發(fā)作至采集樣品的時(shí)間之間，沒有顯著差異。測試的血漿樣本中，88%和66%顯示有針對RBD特異的IgG和IgM抗體(高于對照組至少2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)。然而血漿樣本中抗三聚體S蛋白的IgG和IgM抗體應(yīng)答只有40%和21%(高于對照組至少2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)。IgG和IgM抗體水平與樣本是發(fā)病后多久采集、年齡、性別、病例或接觸者之間沒有顯著差異。相反，IgG抗體與RBD和S蛋白的結(jié)合與癥狀的持續(xù)時(shí)間直接相關(guān)，但I(xiàn)gM抗體與RBD和S蛋白的結(jié)合與癥狀的持續(xù)時(shí)間無關(guān)。最后，對S蛋白的抗體水平，性別間差異不大，但是女性對RBD的IgG結(jié)合抗體的效果比男性低。
為了測量恢復(fù)性血漿的中和活性，研究者使用假病毒測定法，該方法使用攜帶納米熒光素酶報(bào)告基因的HIV-1基病毒粒子和SARS-CoV-2 S蛋白。用半最大中和效價(jià)(NT50)衡量的隊(duì)列中的中和活性總體水平通常較低，無法檢測到的為18%，低于1000的則為78%。NT50的幾何平均值為212(算術(shù)平均值=850)，只有2個(gè)人的NT50達(dá)到5000以上。研究認(rèn)為，中和活性與癥狀的持續(xù)時(shí)間和癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)，但與癥狀，年齡，性別或病例/接觸狀態(tài)的發(fā)作相關(guān)的樣品采集時(shí)間無關(guān)。值得注意的是，結(jié)合RBD和S的IgG抗體的水平與NT50密切相關(guān)。
為了確定由SARS-CoV-2感染引發(fā)的抗體的性質(zhì)，研究者使用流式細(xì)胞儀從6名參與者的血液中分離出了帶有結(jié)合RBD受體的B淋巴細(xì)胞，這6名參與者中包括2名具有最佳抗體中和活性的患者?？乖禺愋訠細(xì)胞的頻率由其結(jié)合藻紅蛋白(PE)和BV711標(biāo)記的RBD的能力確定，在COVID-19恢復(fù)期的循環(huán)B細(xì)胞范圍為0.07至0.005%，但在對照組中無法檢測到。研究者通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR，從6名恢復(fù)期個(gè)體的單個(gè)RBD結(jié)合B細(xì)胞中獲得534對IgG重鏈和輕鏈(IGH和IGL)序列。與人類抗體庫相比，IGH和IGL基因有幾個(gè)明顯超標(biāo)。IGH和IGL的V基因核苷酸突變的平均數(shù)分別為4.2和2.8，這比從患有慢性感染的個(gè)體克隆的抗體中要低，比如乙型肝炎或HIV-1，并且類似于源自原發(fā)性瘧疾感染或非抗原富集的循環(huán)IgG記憶細(xì)胞的抗體。
與其他人類病原體一樣，在所有測試的COVID-19個(gè)體中都有抗原結(jié)合B細(xì)胞的擴(kuò)增克隆。總體而言，復(fù)原IGH和IGL序列的32.2%來自克隆擴(kuò)增的B細(xì)胞(范圍為21.8-57.4%)。在不同個(gè)體中共享IGHV和IGLV基因特定組合的抗體占所有克隆序列的14%。值得注意的是，在不同個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的一些抗體的氨基酸序列幾乎相同。例如，在不同個(gè)體中反復(fù)發(fā)現(xiàn)的具有IGHV1-58/IGKV3-20和IGHV3-30-3/IGKV1-39的克隆抗體的氨基酸序列，同一性高達(dá)99%和92%。研究者得出的結(jié)論，對SARS-CoV-2RBD的IgG記憶反應(yīng)在周期性克隆擴(kuò)增的抗體序列中高度豐富。
為了檢查抗SARS-CoV-2抗體的結(jié)合特性，研究者表達(dá)了34種代表性抗體，其中24種來自克隆，10種來自單體(3個(gè)參與者血漿中發(fā)現(xiàn))。ELISA分析顯示，94%(34種抗體中的32種)以6.6ng/mL的半最大有效濃度(EC50)與SARS-CoV-2RBD結(jié)合，。為了確定這些抗體是否具有中和活性，研究者針對SARS-CoV2-Strunc假病毒進(jìn)行了測試。在測試的32種RBD結(jié)合抗體中，發(fā)現(xiàn)20種可以在納克/毫升數(shù)量級的半最大抑制濃度(IC50)下有小中和，濃度范圍為4.4至709納克/毫升。在個(gè)體中發(fā)現(xiàn)有效的中和抗體，與血漿NT50無關(guān)。例如，從血漿NT50值分別為5053和298的個(gè)體COV21和COV107獲得了C002和C121，IC50分別為8.9和6.7ng/mL。最后，具有共享IGHV和IGLV基因的抗體的克隆是最好的中和劑之一，例如具有IGHV3-30/IGKV1-39的抗體C002，這兩個(gè)供體均具有最好的血漿中和活性。研究者得出的結(jié)論是，即使具有中等血漿中和活性的人，也具有產(chǎn)生有效SARS-CoV-2中和抗體的罕見IgG記憶B細(xì)胞。為了確定具有中和活性的人抗SARS-CoV-2單克隆抗體是否可以結(jié)合到RBD上的不同域，研究者進(jìn)行了雙層干涉測量實(shí)驗(yàn)，其中將預(yù)先形成的抗體-RBD免疫復(fù)合物暴露于第二種單克隆抗體。測試的抗體包括2組，而C002和C105與預(yù)先形成的C121-RBD復(fù)合物結(jié)合，而C104，C110和C119沒有。結(jié)論是，像SARS-CoV一樣，SARS-CoV-2的RBD上至少存在2個(gè)不同的中和表位。通過單細(xì)胞抗體克隆，個(gè)體在自然感染中獲得了對病毒和寄生蟲等病原體具有中和活性的人單克隆抗體。在模型生物和早期臨床研究中，已經(jīng)顯示出幾種有效的保護(hù)和治療方法，但是目前只有一種抗病毒單克隆藥物正在臨床使用。與小分子藥物相比，抗體相對昂貴并且更難以生產(chǎn)。但是，它們與藥物的不同之處在于，它們可以通過與宿主免疫細(xì)胞上的Fcγ受體結(jié)合的恒定結(jié)構(gòu)域參與宿主免疫系統(tǒng)。這些相互作用可以增強(qiáng)免疫力并幫助清除病原體或被感染的細(xì)胞，但它們也可以導(dǎo)致登革熱以及冠狀病毒感染增強(qiáng)。這個(gè)問題阻礙了登革熱疫苗的開發(fā)，但不會干擾有效的中和抗體的臨床應(yīng)用，可以對其進(jìn)行修飾以防止Fcγ受體相互作用并保持對病毒病原體的保護(hù)作用?？贵w是大多數(shù)疫苗必不可少的元素，可能會成為抗SARS-CoV-2的有效疫苗的關(guān)鍵組成部分。觀察表明，大多數(shù)恢復(fù)期患者的血漿中和活性較低，但是在血漿中和活性異常的患者中可以發(fā)現(xiàn)具有有效中和活性的抗SARS-CoV-2RBD復(fù)發(fā)的抗體，這表明人類具有內(nèi)在的能力產(chǎn)生抗RBD能有效中和SARS-CoV-2的抗體。因此，特異性和有效地誘導(dǎo)靶向SARS-CoV-2RBD的抗體的疫苗可能是特別有效的。參加者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征：
